그린비 바이오

: #PCR #cDNA 합성 #qPCR #Cloning #Recombinant Protein #ELISA #Cell culture #Antibody #Assay #전기영동 #NGS #Gene transfer #DNA/RNA 정제 #단백질 검출, 발현, 정제 #기기, 소모품 #기타

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그린비 블로그

[Cell culture guide] 2편, 세포유지 - 당신이 애써 키운 세포를 건강하게 유지하기 위한 기술

24-05-27 08:56

Assay Genie가 깔끔하게 정리해 드리는 Cell Culture 가이드 2편!

'Cell Culture 가이드 1편 (세포배양이란?)'에 이어

이번에는 좋은 논문을 내기 위한 기본,

건강한 세포를 유지하는 기술에 대해 알아봅니다.

함께 살펴보시죠!

2.4 세포 확인 필수

세포는 현미경으로 매일 관찰하여 건강하고 예상대로 자라고 있는지 꼭 확인해야 합니다.

그리고, 현미경에서 건강한 세포가 어떻게 보이는지 익히는 것이 중요해요.

세포의 형태 변화를 통해 성장이 정지된 세포나 감염된 세포를 더 쉽게 감지할 수 있기 때문이에요.

사진: Unsplash의 Drew Hays

[ 세포를 폐기해야 하는 경우 ]

세포 배양 배지가 분홍/빨간색에서 탁한 노란색으로 변색된 경우 (무균 조작법이 작동되지 않아 세포 감염이 됨)

2. Adherent cell이 배양용기 바닥에서 대량으로 떨어져 분리되는 경우 (세포사멸을 의미함)

3. 세포 모양이 극적으로 변화한 경우 – 세포가 흩어져 있거나, 모양이 선명하지 않게 보이는 경우

4. 세포 성장 분화가 중단된 경우

사진: Unsplash의 National Cancer Institute

2.5 Splitting cells (세포의 분할)

포유류 세포는 플라스크의 70-80%가 세포로 덮여 confluence(합류점)에 도달하면 split/passage를 하게 돼요.

Adherent cell(부착 세포)은 현미경으로 관찰했을 때 세포 성장을 위한 공간이 더 이상 없는 것으로 confluence를 확인할 수 있어요.

Suspension cell(부유 세포)의 경우, 플라스크를 돌려보았을 때 세포가 뭉치고 배지가 탁해 보일 때 confluence를 판단합니다.

세포가 배양 용기에서 넘치지 않도록 하는 것이 중요하며, 70-80% 정도 차는 것 가장 이상적이에요.

이 지점을 넘어서면, contact inhibition(접촉 저해)이 나타나고 다시 세포를 심은 후 회복 기간이 더 길어집니다.

Cell line의 성장 속도에 따라 사용되는 split ratio(분리 비율)를 결정하게 되는데요,

예를 들어 천천히 성장하는 cell line은 높은 비율로 split 하는 것은 바람직하지 않아요.

빠르게 성장하는 cell line은 느리게 성장하는 cell line에 비해 confluency에 빨리 도달하기 때문에 높은 split ratio가 필요할 수 있습니다.

일반적으로 세포는 1:10 이상 split 하지 않는데요, 이 비율은 세포가 생존하기에 너무 낮은 비율이기 때문이에요.

다양한 seeding density를 적용하여 세포배양을 해본다면, 특정 날짜에 실험할 준비가 되도록 조절할 수 있게 되지요.

일반적으로, 실험에 적합한 70~80% confluent 가 되는 조건은

1:2 split --> 1-2일 후

1:5 split --> 2-4일 후

1:10 split --> 4-6일 후 정도로 예상됩니다.

하지만 위 조건들은 각 cell line의 성장 속도에 따라 달라질 수 있다는 점! 참고해 주세요~

< 세포 배양 희석 1 >

< 세포 배양 희석 2 >

2.6 세포 splitting 프로토콜

1. 세포가 적어도 80% confluent 인지 확인하세요.

2. 새로운 배지를 37°C water bath 또는 인큐베이터에서 30분 이상 예열하세요.

3. 플라스크에 passage number, cell line, split ratio, 날짜를 정확하게 기입하세요.

4. 10% sodium hypochloride가 포함된 약 100ml의 배지를 버리기 위해 표백제가 들어있는 폐기물 용기를 준비해 주세요.

[ Loosely adherent cell의 경우 (cell scraping) ]

단 계	과 정
1.	Media를 폐기물 용기에 조심스럽게 버립니다.
2.	같은 양의 예열된 새로운 배지를 플라스크에 넣어줍니다.
3.	Cell scraper를 사용하여 플라스크 바닥의 세포를 부드럽게 긁어냅니다.
4.	모든 세포가 플라스크에서 완전히 떼어냈는지 확인합니다.
5.	Serological pipette을 사용하여 필요한 양의 cell suspension을 취합니다. 예를 들어, 100ml에서 1:2 split 하려면 새 플라스크에 50ml를 넣고, 100ml에서 1:5 split 하려면 새 플라스크에 20ml를 넣고, 100ml에서 1:10 split 하려면 새 플라스크에 10ml를 넣습니다.
6.	Split ratio를 고려하여 필요한 양을 예열된 새로운 배지에 추가합니다. 예를 들어, 25cm2 플라스크 약 5-10ml, 75cm2 플라스크 약 10-30ml, 175cm2 플라스크 약 40-150ml

[ Adherent cell의 경우 (Trypsin) ]

단 계	과 정
1.	플라스크의 배지를 폐기물 용기에 조심스럽게 버립니다.
2.	무균 조작법으로 예열된 PBS를 플라스크에 피펫 하여 세포를 세척하고 잔류 배지와 FBS를 제거합니다.
3.	플라스크를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 PBS로 세포를 헹구는 과정을 3회 반복합니다. 효율적인 trypsinization(트립신화)을 위해 잔류 FBS를 제거하는 것이 중요합니다.
4.	세척이 완료되면 예열된 trypsin EDTA를 추가합니다. 세포가 덮일 수 있도록 충분한 trypsin이 사용되어야 합니다. 플라스크 사이즈에 따라 25cm2 --> 약 1ml, 75cm2 --> 약 5ml, 175cm2 --> 약 10ml 적용
5.	PBS와 마찬가지로, 플라스크를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 trypsin이 플라스크 바닥 전체에 닿을 수 있도록 합니다.
6.	플라스크를 37°C 인큐베이터에 넣습니다. Cell line에 따라 다른 trypsin 처리 시간이 필요하고, 세포를 심하게 손상시킬 수 있는 over-trypsinization를 방지하기 위해서 몇 분마다 현미경으로 관찰하는 것이 중요합니다. 이때, 세포가 플라스크 바닥에서 잘 떼어질 수 있도록 플라스크를 가볍게 두드려 줍니다.
7.	세포가 분리되면 배지를 플라스크에 넣어주는데, 배지에 포함된 FBS가 trypsin을 비활성화합니다.
8.	플라스크의 바닥을 위아래로 부드럽게 피펫팅 하여 아직 부착상태의 세포를 떼어냅니다.
9.	세포를 카운팅하고 필요한 양의 세포를 새 플라스크로 피펫팅하고, 플라스크에 필요한 부피까지 culture media를 채웁니다. 플라스크 사이즈에 따라서 25cm^2 --> 약 5-10ml 75cm^2 --> 약 10-30ml 175cm^2 --> 약 40-150ml
10.	인큐베이터에서 하루 동안 세포 회복 및 플라스크에 정착이 되도록 합니다.

* Trypsinization은 일부 세포에 해로울 수 있습니다.

또한 일부 막단백질의 일시적인 internalization을 유도할 수 있기 때문에 trypsin 사용은 실험 디자인 단계에서 고려되어야 해요.

실험에 영향이 있는 경우, gentle cell scraping 또는 detergent 등 다른 방법이 대안으로 사용될 수 있어요.

[ Suspension cell의 경우 ]

단계	과 정
1.	일부 suspension cell line은 권장하는 split ratio 또는 sub-culturing cell density 정보가 있으므로, 실험 시작 전에 이를 확인합니다.
2.	피펫을 사용하여 플라스크에서 필요한 양의 cell suspension을 꺼내 새 플라스크에 옮깁니다. 예를 들어 cell suspension 100ml에서 1:2 split의 경우 50ml 1:5 split의 경우 20ml
3.	새로운 플라스크에 필요한 양의 예열된 배지를 넣어 줍니다. 예를 들어, 100ml에서 1:2 split --> 세포 50ml, 배지 50ml 1:5 split --> 세포 20ml, 배지 80ml