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그린비 블로그

[Cell culture guide] 3편, 세포 보관 및 관리 - 최상의 컨디션으로 실험을 하기 위한 기본 세팅

24-05-27 09:00

Assay Genie가 깔끔하게 정리해 드리는 Cell Culture 가이드 3편!

앞서 Cell Culture에 관한 시리즈를 모두 확인해 보셨나요?

1편, 세포 배양(Cell Culture)이란?

2편. 세포 유지 - 당신이 애써 키운 세포를 건강하게 유지하기 위한 기술에 이어

오늘은 최종 편으로

세포를 보관하고 관리하는 방법에 대해 알아봅니다.

잘 키운 나의 소중한 세포들,

변형 없이 안전하게 보관하고 관리하는 기술도 매우 중요하지요.

세포 배양 실험의 정석을 확인해 주세요!

2.9 세포의 동결

Cell line을 동결하는 것은 세포 배양에 필수적인 요소인데요,

cell line 교체에 시간과 비용이 많이 걸리기 때문이에요.

세포가 감염되었을 때에는 따로 동결 보관된 stock을 가지고 다시 실험을 시작할 수 있어요.

그래서, 잉여 세포가 생기는 대로, 유전적 변이를 제한하기 위해서

가급적이면 낮은 passage number의 세포를 seed stocks으로 동결시켜야 합니다.

가장 좋고 널리 사용되는 세포 동결 방법은,

배지에 DMSO(dimethylsulfoxide)와 같은 cryoprotective agent를 넣어 액체 질소에 세포를 저장하는 방법이에요.

DMSO와 같은 cryoprotective agent는 media의 어는점을 낮추고 냉각 속도를 저하시켜서

세포사멸 및 손상을 일으키는 얼음 결정 형성의 위험을 감소시킵니다.

[ 세포 동결 프로토콜 ]

단 계	과 정
1.	Cell count를 통해 생존 가능한 세포 수를 계산하고, 필요한 freezing media의 양을 결정합니다.
2.	Cell suspension을 원심분리합니다. 원심분리 속도와 시간은 세포의 종류에 따라 달라질 수 있습니다.
3.	Pellet을 건드리지 않고 상등액을 제거합니다.
4.	Cell type에 대해 권장되는 세포 밀도에 맞게 pellet을 feezing media에 resuspend 합니다.
5.	Cell suspension을 cryogenic storage vial에 분주하고 날짜, cell type, passage number를 명확하게 기록합니다.
6.	프로그램 세포 냉동장치(controlled rate freezing apparatus)에 cryovial을 넣고 분당 약 1°C씩 온도를 낮추면서 동결시킵니다. 또는 cyrovial을 isopropanol chamber에 넣고 -80°C overnight 보관합니다.
7.	동결된 세포를 액체 질소 탱크로 옮겨서, 액체 질소 위의 기체상(gas phase)에 저장합니다.

꼭 확인하세요!

1. 배양된 세포를 가능한 낮은 passage number에서 고농도로 동결합니다.
2. 세포를 냉동하기 전에 최소한 90%의 세포가 생존할 수 있는지 확인합니다.
3. 동결 세포를 보관할 때는 항상 멸균된 cryovials을 사용합니다.
4. 항상 적절한 무균 조작법을 사용하고 laminar flow hood에서 작업합니다.

안전 참고 사항:

DMSO는 organic material이 조직으로 유입되는 것을 촉진한다고 알려져 있으므로, 사용할 때 주의를 기울여야 합니다.

이 시약을 취급할 때는 장갑과 적절한 보호복을 착용하고, 시약은 규정을 준수하여 폐기합니다.

2.10 동결 세포의 해동

해동 과정(thawing)은 동결 세포에 매우 큰 스트레스를 주게 됩니다.

때문에 천천히 진행해야 하는 동결과정과는 달리,

해동 과정은 세포의 높은 생존율을 보장하기 위하여 가능한 한 빠르게 진행해야 해요.

[ 세포 해동 프로토콜 ]

단 계	과 정
1.	주의하여 액체 질소로부터 세포가 들어있는 cryovial을 꺼냅니다.
2.	동결 세포는 즉시 해동합니다. 일반적으로 액체 질소 용기에서 동결 바이알을 37°C씨 수조로 옮겨서 1분내에 해동 시킵니다.
3.	세포가 녹으면 laminal flow hood로 이동합니다.
4.	해동된 세포를 원하는 양의 예열된 media가 들어 있는 centrifuge tube에 조금씩 옮겨줍니다.
5.	Cell suspension을 원심분리합니다. 원심분리 속도와 시간은 세포의 종류에 따라 달라질 수 있습니다.
6.	원심분리 후 pellet을 건드리지 않고 상등액을 제거합니다.
7.	새로운 media를 넣어 조심스럽게 resuspend 하고, 적절한 크기의 플라스크에 옮겨서 배양합니다.

2.11 Mycoplasma 테스트

세포 배양 실험실에서 가장 흔한 오염물질 중 하나는 바로 mycoplasma입니다.

Mycoplasma는 세포벽이 없는 박테리아로, 가장 작은 self-replicating organism(자가증식하는 생물)로 간주되는데요,

그 크기가 약 1 마이크로미터보다 작기 때문에 발견하기가 매우 어렵고,

밀도가 매우 높아져서 세포 배양을 악화시킬 때까지 발견하기 어렵기 때문에 오염을 초기에 막지 못하게 되는 경우가 많아요.

느리게 성장하는 많은 mycoplasma는 세포사멸을 유발하지 않고 발견되지 않은 상태로 있을 수 있지만,

세포 배양 시, host cell(숙주 세포)의 작용과 대사과정을 변화시킬 수 있어요.

만성 mycoplasma 감염은 세포 증식 감소, 포화 밀도 감소, suspension culture에서 응집 등을 초래할 수 있어요.

이러한 mycoplasma 감염을 탐지하는 방법은

형광 염색(예: Hoechest), ELISA, PCR, immunostaining, autoradiography 또는 microbiological assays를 사용하여

세포 배양을 주기적으로 검사하는 것입니다.

사진 출처 : namu.wiki

2.11.1 항생제 사용

세포 배양에서 항생제는 최소한으로 사용해야 해요.

항생제의 지속적인 사용은 항생제 내성을 촉진하고, 낮은 수준의 오염의 지속시키며, 다양한 오염이 가려질 수 있기 때문이에요.

또한, 일부 항생제는 세포와 교차 반응하여 연구 중인 세포 과정에 영향을 줄 수 있습니다.

3. 세포 배양 장비

세포 배양 실험실은 연구기관, 조사분야에 따라 크게 달라질 수 있습니다.

그러나 모든 세포 배양 실험실은 몇 가지 필수적인 공통 장비와 요구 사항이 있는데요,

그중 가장 중요한 것은 무균 환경의 유지입니다.

아래는 세포 배양 실험실에서 갖춰야 하는 일반적인 장비와 재료의 목록입니다.

여기에 모든 것들이 포함되어 있지는 않으며, 연구 영역에 따라 차이가 있을 수 있다는 점 참고해 주세요.

기본 장비

- 세포 배양 후드 (예: laminar-flow hood 또는 biosafety cabinet)
- 인큐베이터 (humind CO₂ 인큐베이터 권장)
- Water bath
- 원심분리기
- 냉장고 및 냉동고(–20°C)
- Cell counter (Automated Cell Counter 또는 hemocytometer)
- Inverted microscope
- 액체 질소(N₂) 냉동고 또는 cryostorage container
- 세포 배양 용기 (예: flasks, Petri dishes, roller bottles, multiwell plates)
- Pipettes and pipettors
- 주사기와 바늘
- 폐기물 용기
- Media, serum 및 시약
- 세포

여기까지 세 편의 포스트에 걸쳐 Cell culture 가이드를 정리해 보았습니다.

실험 계획과 점검에 도움이 되셨나요?

Cell Culture에 관한 영어 원문은 아래 링크에서 확인하실 수 있어요.

Cell Culture - Step by Step Guide

This guide covers all of the essential techniques and protocols you need to know for mammalian cell tissue culture including splitting cells, cell scraping & freezing cells.

www.assaygenie.com

마지막으로, 한 가지 더!

위에서 말씀드렸듯이

소중한 세포를 안전하게 배양하고 유지하기 위해서

마이코플라스마 오염 테스트는 매우 중요합니다.

Assay Genie의 Mycoplasma Detection & Elimination Kits 제품으로

마이코플라스마 오염을 눈으로 빠르게 감지하고

항생제 내성 마이코플라스마까지 쉽게 제거할 수 있답니다!

Assay Genie의 MycoGenie Rapid Mycoplasma Detection & Elimination Kits!

를 사용해보세요.

	Rapid Mycoplasma Detection Kit Mycoplasma 감염 여부를 신속하고 간단하게 검출
	MycoGenie MycoPlasma Elimination Kit Cell culture 배지와 혈청에 감염된 Mycoplasma 제거