그린비 바이오

: #PCR #cDNA 합성 #qPCR #Cloning #Recombinant Protein #ELISA #Cell culture #Antibody #Assay #전기영동 #NGS #Gene transfer #DNA/RNA 정제 #단백질 검출, 발현, 정제 #기기, 소모품 #기타

: #PCR #cDNA 합성 #qPCR #Cloning #Recombinant Protein #ELISA #Cell culture #Antibody #Assay #전기영동 #NGS #Gene transfer #DNA/RNA 정제 #단백질 검출, 발현, 정제 #기기, 소모품 #기타

그린비 블로그

[Cell Culture 가이드] 1편, 세포 배양(Cell Culture)이란?

24-05-27 08:24

AssayGenie가 깔끔하게 정리해 드리는 Cell Culture 가이드!

앞으로 3편의 포스트를 통해 세포 배양에 대한 모든 것을 알아보겠습니다.

1편, 세포 배양이란?

2편, 세포 유지 기술

3편, 세포 보관 및 관리

세포 배양은 동물이나 식물의 조직에서 세포를 추출하여

체외 환경에서 최적의 조건을 제공하여

세포를 키우는 기술이에요.

세포 배양은 세포와 분자 생물학에서 중요한 툴이며,

세포 생리학과 세포 생화학의 모델링을 가능하게 해요.

또한, 세포 배양을 통해 연구자들은 약물과 독성 화합물이

세포 반응에 미치는 영향을 확인할 수 있어요.

이번 시간에는 세포 배양의 이유와 활용, 기본적인 테크닉과 방법을 소개할게요!

세포 배양의 키포인트!

1. 세포 생리학과 반응을 연구하기 위한 툴로써, 세포 및 분자 생물학에서 매우 중요해요.

2. 무균 기술, 특정 배지 준비 과정과 제어된 환경이 요구되죠.

3. 세포 유형(primary culture(일차배양) vs 세포주, 부착 세포 vs 부유 세포)에 대한 이해가 매우 중요해요!

4. 세포 배양 기술에는 세포 split, 배지 교체, passage number 기록 등이 포함돼요.

5. 세포의 동결과 해동은 세포 보존과 생존에 매우 중요하죠.

6. 준비물로는 Laminar flow hood, 후드, 인큐베이터, 현미경 및 세포 배양 용기 등이 필요해요.

1. Introduction

세포 배양은 clonal cell(단세포주)을 사용함으로써 결과의 일관성과 재현성을 얻을 수 있어,

오늘날 연구에서 가장 널리 사용되는 기술 중 하나이죠.

세포마다 최적의 성장을 위해 필요한 배양 조건이 다르므로,

medium(배지) 선택과 supplement(성분 추가)를 통해 적절한 요건을 맞추어야 해요.

배지를 통해 필수 영양소(아미노산, 탄수화물, 비타민, 미네랄), 성장 인자, 호르몬, 기체(O₂, CO₂)를 공급하고

추가로 pH, 삼투압, 온도 등의 생리화학적 환경을 조절해 주어야 합니다.

1.1 Primary Culture vs Cell Line

Primary culture란 조직 분리 후 직접 배양된 세포예요.

이 세포들이 confluent(세포가 플라스크의 모든 가용 공간을 차지함) 하게 되면,

passage 또는 split을 통해 새로운 용기로 옮겨주어야 해요.

첫 번째 passage 후에는 세포주(cell line)라고 하는데요,

primary culture에서 유래한 세포주는 수명이 제한되어 있어요.

이것은 세포가 노화되기 전에 제한된 횟수만 분열할 수 있다는 것을 의미해요.

이 세포들은 가장 높은 성장 능력을 가진 계대 세포이기 때문에, 유전형과 표현형의 균일성을 가지고 있어요.

Immortal cell line(불멸 세포주)은 노화와 같은 문제를 피하기 위해 세포 및 분자생물학에서 널리 사용되고 있죠.

세포는 자연발생적, 화학적, 또는 바이러스 등을 통해 변형되고 불멸화될 수 있는데요,

일단 변형되면 이 세포들은 무한히 분열하여 지속적인 cell line이 될 수 있습니다.

사진: Unsplash의 Drew Hays

1.2 Adherent cells (부착 세포)와 Suspension cells (부유 세포)

1. Adherent (Anchorage dependent, 부착 의존성)

Adherent cell은 고체 또는 반고체 기질(substrate)에 부착된 상태에서 배양해야 하며,

종종 subculture(계대 배양)을 위해 trypsinization(트립신화)이 필요해요. (자세한 내용은 다음 포스트 2.6 참조)

2. Suspension (Anchorage Independent, 부착 비의존성)

Suspension cell은 고체 성장 기질을 필요로 하지 않으며, culture medium에서 부유한 상태로 성장할 수 있어요.

2. 세포 배양 가이드라인

모든 세포 배양 작업은 무균 조작법을 사용하여 microbiological safety cabinet에서 수행해야 하고

배양실 내에서는 보호복을 항상 착용해야 합니다.

2.1 무균 조작법과 Laminar Flow Hood의 준비

무균 조작법(aseptic technique)은 무균 환경을 조성하고, 미생물과 멸균 상태의 세포 배양 후드 사이에 장벽 역할을 하도록 설계되었어요.

멸균된 시약과 media를 사용하는 것이 중요하고,

70% 에탄올을 뿌리지 않은 물체는 어떤 것도 후드에 들어 들어가지 않는 것을 원칙으로 합니다.

[ Laminar Flow Hood의 준비 ]

세포 배양 후드는 무균 작업 공간을 제공하는 동시에, 미생물에 의한 감염을 차단해요.

연구와 생물학적 안전 요구를 충족하기 위해 Class I, II, III로 분류된 세 가지 종류의 세포 배양 후드가 있고,

각 실험에 맞는 장비를 선택해야 합니다.

[ Laminar Flow Hood 사용법 ]

단계	과 정
1.	커버를 제거하고 후드를 켭니다.
2.	후드 섀시를 적절한 위치로 닫아 laminar air flow을 유지합니다.
3.	후드의 모든 표면 부위에 70% 에탄올을 분사합니다.
4.	정돈된 상태를 유지합니다.
5.	사용한 모든 장비(pipette tips, pipette, racks, eppis(Eppendorf tube), 플라스크, 시약 등)를 후드에 넣기 전에 멸균 상태인지 확인합니다. 이를 위해 autoclave 작업을 하거나, pre-autoclaved DNA/RNAse free 장비를 이용할 수 있습니다. 피펫과 rack에 70% 에탄올을 분사합니다.
6.	모든 media, supplement 및 시약은 세포 배양에서 미생물이 자라지 않도록 멸균해야 합니다. 일부 시약 및 supplement는 멸균되지 않았을 경우 필터 멸균이 필요합니다.
7.	Media나 시약을 병이나 플라스크에서 직접 붓지 않습니다.
8.	교차 오염을 방지하기 위해 각 피펫은 한 번만 사용합니다.
9.	멸균 피펫은 사용할 준비가 될 때까지 포장을 뜯지 말고, 후드 내부에서 개봉합니다.
10.	멸균 플라스크, 병, 페트리 접시 등은 사용할 준비가 될 때까지 절대 뚜껑을 열지 않으며, 개봉한 채로 방치하지 않습니다. 조작을 마치는 대로 덮개를 덮습니다.
11.	캡 또는 커버를 열어 작업 표면에 내려놓아야 하는 경우, 개구부가 위를 향하도록 놓습니다.

사진: Unsplash의 Bret Kavanaugh

2.2 Cell Growth Media의 준비

먼저, 배양하는 cell line에 적합한 media 와 supplement를 확인합니다.

시약은 항상 멸균 상태여야 하며, 후드 내부에서만 개봉해야 해요.

대부분의 cell line은 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM glutamine 및 항생제를 첨가한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) culture media 또는 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) culture media를 사용합니다.

[ DMEM Media 준비 방법 ]

단계	과 정
1.	배지 500ml 병에서 50ml을 덜어냅니다.
2.	부피는 450ml가 됩니다.
3.	10% FBS = 50ml 추가합니다.
4.	Supplement 2 mM glutamine = 5 ml, 100 U penicillin / 0.1 mg/ml steptomycin = 5 ml 을 첨가합니다.

2.3 올바른 배양 환경 조성

특정 endothelial cell line은 성장하기 위해 특별한 collagen matrix가 필요해요.

이러한 매트릭스는 cell line의 부착, 분화 및 성장을 보장합니다.

세포 배양 실험을 시작하기 전에 문헌을 확인하여 매트릭스와 같은 추가 성장 조건이 필요한지 확인하는 것이 중요해요.

또한 사용 중인 플라스크의 종류(예: vented 또는 non-vented)에 유의합니다.

Non-vented/plug 플라스크를 사용할 경우, 가스 교환이 가능하도록 캡을 느슨하게 닫아야 하고,

Vented 플라스크를 사용할 경우, 가스교환 효율에 영향을 미치므로 캡의 필터가 젖지 않도록 조심합니다.

[ Endothelial cell과 epithelial cell을 위한 1% Gelatin matrix 제조 방법 ]

단 계	과 정
1.	1% 젤라틴/1% 피브로넥틴으로 구성된 코팅액 10 mL를 증류수로 희석하여 여과하여 준비합니다.
2.	이 코팅액으로 약 5개의 플라스크를 코팅합니다.
3.	코팅액을 플라스크에 피펫팅합니다.
4.	플라스크에 매트릭스를 고르게 분포시키기 위해 앞뒤로 흔들어 줍니다.
5.	인큐베이터에 15-30분간 보관합니다.
6.	Seeding 전에 코팅액을 흡입(aspiration) 하여 완전히 제거합니다.