Assay Genie의 3D Organoid Cell Viability Assay에 대해 알아보겠습니다.

기도 감염은 주로 바이러스 감염에 의해 발생하고, 전 세계 사망 원인 4위입니다.
Apical-out 호흡기 오가노이드는 인간 호흡기 상피1를 모방한 혁신적인 3D 모델입니다.

이는 바이러스 진입, 독성, 세포 발병 기전, 약물 안전성, 면역 반응 및 대용량 약물 스크리닝 연구를 포함한 의료 바이러스학 분야의 다양한 응용에 사용될 수 있습니다.
그러나 오가노이드와 3D 모델의 복잡한 특성 때문에 세포 증식, 생존율 및 세포 독성을 정확하게 측정할 수 있는 시약이 부족한 상태입니다.

이 연구에서, 우리는 AssayGenie의 3D Organoid Cell Viability Assay 제품이 처리량이 높은 384 well 형식으로 3D 호흡기 오가노이드의 세포 생존력을 측정하는 탁월한 시약이며 다른 주요 시약에 비해 훨씬 우수한 결과를 제공한다는 것을 보여줍니다.

Stroulios G, Brown T, Moreni G, et al. Apical-out airway organoids as a platform for studying viral infections and screening for antiviral drugs.

Sci Rep. 2022;12(1):7673. Published 2022 May 10. doi:10.1038/s41598-022-11700-z

어떤 원리로 분석하였는가?

AssayGenie의 3D Organoid Cell Viability Assay는 세포 배양 상층액과 3D 오가노이드 모델에서 직접 살아있는 생존 세포의 수를 정량화하기 위한 매우 민감한 1-step kit입니다.

이 제품은 세포 증식 및 세포 독성 연구에 적합하고, High-throughput 384-well 포맷의 Apical-Out 기도 오가노이드 뿐만 아니라 2D 세포 배양에서도 검증되었습니다.

이 기술은 WST-8 Tetrazolium salt가 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 오렌지색 생성물로 환원되는 것을 450nm에서 측정하는 것을 기반으로, 결과는 생존 세포 수에 정비례합니다.

WST-8은 세포독성 프로파일이 낮은 세포배양 배지에 매우 잘 녹으며, 전처리나 wash 단계 없이 배양된 세포에 직접 첨가할 수 있습니다.

특히 24시간이나 48시간 같이 긴 배양 과정을 필요로 하는 고 처리량 및 민감한 실험에 매우 적합합니다. 이 키트는 MTS, MTT, PrestoBlue 또는 XTT와 같은 다른 Tetrazolium 시약보다 훨씬 높은 감도와 낮은 세포 독성을 보입니다.

분석에 쓰인 재료와 방법은?

• Multimode reader
• 384-w dark plate with clear bottom Corning ®
• DMSO (Sigma)

프로토콜

1. 실험실에서 준비한 75~100/well apical out 오가노이드를 384well plate에 triplicate로 분주한다.
2. 50μl 최종 volume으로 0.1% 와 10% DMSO를 음성 및 양성 대조군으로 첨가한다.
3. 37°C, 5% CO2 환경에서 2일 동안 배양한다.
4. 5μl의 3D Organoid Cell Viability Assay CCK8 버퍼 또는 Prestoblue 시약을 각 well에 첨가하고 1시간, 3시간 또는 OVN 배양한다.
5. 3D Organoid Cell Viability Assay CCK-8 버퍼를 첨가한 well은 490nm에서 측정하고, PrestoBlue는 ex 535nm/em 595nm에서 측정한다.
6. 세포 생존율(%)은 OD, 샘플, 대조군 및 blank를 활용하여 계산한다.

분석 결과와 그에 대한 해석입니다.

Table 1: Dataset obtained with Spectra

		ASSAY GENIE (OD)				PRESTOBLUE Assay (RFU)
		Mean OD				Mean RFU
1h incubation	Blk	0.464	0.413	0.455	0.444	1.70E+05	1.70E+05	1.68E+05	1.69E+05
	Control	0.722	0.572	0.522	0.605	9.52E+06	3.59E+06	5.28E+06	6.13E+06
	0.1% DMSO	0.606	0.667	0.680		4.07E+06	9.13E+06	2.28E+06
	10% DMSO	0.434	0.473	0.434		7.49E+05	2.06E+06	3.81E+05
3h incubation	Blk	0.455	0.389	0.422	0.422	5.38E+05	4.82E+05	5.75E+05	5.32E+05
	Control	1.201	0.831	0.624	0.885	1.51E+07	9.33E+06	2.17E+07	1.54E+07
	0.1% DMSO	0.818	0.949	0.922		8.98E+06	1.73E+07	6.66E+06
	10% DMSO	0.426	0.443	0.405		2.99E+06	7.17E+06	1.84E+06
OVN	Blk	0.793	0.745	0.773	0.770	1.63E+06	1.48E+06	1.75E+06	1.62E+06
	Control	4.000	4.000	3.162	3.721	5.73E+07	5.06E+07	5.93E+07	5.57E+07
	0.1% DMSO	4.000	4.000	4.000		4.63E+07	4.98E+07	3.57E+07
	10% DMSO	1.093	0.842	0.863		1.37E+07	3.28E+07	7.25E+06

A) 3D Apical-out 오가노이드는 0.1% DMSO로 처리되었으며 1시간, 3시간 및 OVN 배양한 후 Assay Genie의 3D Organoid Cell Viability Assay 또는 ThermoScientific PrestoBlue 시약으로 측정함.

PrestoBlue 시약을 사용할 때에는 생존율 감소를 보였지만, Assay Genie의 3D Organoid Cell Viability Assay를 통해 얻은 세포 생존율은 모든 시점에서 100% 이상임.

B) 3D Apical-out 오가노이드의 세포 사멸을 측정하기 위해 10% DMSO를 처리했고 생존율은 1시간, 3시간 및 OVN 배양한 후 Assay Genie 3D Organoid Cell Viability Assay 또는 ThermoScientific PrestoBlue 시약으로 측정함.

오가노이드에 대한 3D Organoid Cell Viability Assay를 통해 얻은 세포 생존력은 0.5%에서 5.9% 범위로 감소했습니다.

입증된 3D Organoid Cell Viability Assay의 우수성

AssayGenie의 3D Organoid Cell Viability Assay는 Apica-out airway 3D 오가노이드 세포 생존율 테스트에서 다른 resazurin 방법보다 우수한 결과를 보이는것을 확인할 수 있었습니다.